簡(jiǎn)介

作為噬菌體衍生的酶，內(nèi)溶素本質(zhì)是一種蛋白分子，其通過(guò)分解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖成分，幫助噬菌體顆粒從細(xì)菌宿主釋放，可在噬菌體復(fù)制過(guò)程中表達(dá)，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的關(guān)鍵化學(xué)鍵。

原理

通過(guò)內(nèi)溶素的蛋白表達(dá)、純化能夠?qū)?nèi)溶素基因克隆到表達(dá)載體（如 pET28a），進(jìn)一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，重組質(zhì)粒經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，得到經(jīng)鎳柱純化的內(nèi)溶素蛋白。

用途

為治療抗生素耐藥的細(xì)菌感染提供潛在解決方案。

材料與儀器

儀器：

離心機(jī)、超聲破碎儀

恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、PCR 儀、電泳儀

凝膠掃描儀、鎳柱純化系統(tǒng)、0.22 μm 濾膜

試劑：

質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒

核酸內(nèi)切酶、T4 連接酶、Pfu 聚合酶

IPTG、考馬斯亮藍(lán)

步驟

（1）內(nèi)溶素的克隆

1、引物設(shè)計(jì)：對(duì)待研究的內(nèi)溶素完成基因組測(cè)序注釋工作，根據(jù)已測(cè)基因組進(jìn)行引物設(shè)計(jì) P1 與 P2，并引入酶切位點(diǎn)。

2、PCR 擴(kuò)增內(nèi)溶素基因：反應(yīng)體系與程序見表 1。

3、PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性 30 s，Tm 溫度下退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 最后延伸 10 min，26 ℃ 再反應(yīng) 2 min（終止反應(yīng)）。

4、回收 PCR 產(chǎn)物膠：進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將 50 μL 全部上樣，切下目的基因條帶，使用膠回收試劑盒回收目的基因（一般實(shí)驗(yàn)室都會(huì)有常用品牌）。

5、抽提質(zhì)粒：使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提載體質(zhì)粒（一般實(shí)驗(yàn)室都會(huì)有常用品牌）。

6、對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行酶切：利用一開始設(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)對(duì)載體與目的基因進(jìn)行雙酶切，在 37 ℃ 下反應(yīng) 3 h。

7、切膠回收：將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取含 DNA 片段的目的條帶并進(jìn)行回收，得到 DNA 后檢測(cè)其濃度并保存在 -20 ℃ 冰箱備用。

8、DNA 與載體連接：用 T4 連接酶連接載體與 DNA 片段，在 16 ℃ 下過(guò)夜。

9、轉(zhuǎn)化大腸桿菌：取 50 μL 大腸桿菌 BL21 感受態(tài)細(xì)胞，加入 5 μL 連接液后冰上孵育 30 min，搖勻后 42 ℃ 水浴熱休克 90 s，然后迅速冰浴 2 min，冰浴后再加入已經(jīng)預(yù)熱的 1 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃ 搖床震蕩 1 h 復(fù)蘇，最后涂板至卡那霉素抗性的平板，37 ℃ 溫度下培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單菌落進(jìn)行菌落 PCR，將陽(yáng)性菌落接種于培養(yǎng)基中 37 ℃ 溫度下培養(yǎng)過(guò)夜。

10、抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（參見 5、6 步）。

（2）內(nèi)溶素的表達(dá)與純化

1、少量誘導(dǎo)表達(dá)：挑選單菌落過(guò)夜培養(yǎng)，過(guò)夜菌接種至 1 mL 培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng) 2~3 h，再加入 10 μL 0.1 M 的 IPTG 在 16 ℃ 誘導(dǎo) 4 h，取 20 μL 菌液加入 7.5 μL 的蛋白緩沖上樣液，100 ℃ 沸水煮 10 min 后電泳，倒入考馬斯亮藍(lán)過(guò)夜震蕩，清洗后尋找發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶存在，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。

2、擴(kuò)大培養(yǎng)：將陽(yáng)性菌落涂布平板過(guò)夜，挑選單菌落接種至 10 mL 培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng) 6 h，按  1:100 比例接種于 500 mL 培養(yǎng)液中，37 ℃ 搖床至 OD600 值為 0.6~0.8，加入終濃度為 1 mM 的 IPTG 誘導(dǎo)劑，在 16 ℃ 下繼續(xù)培養(yǎng) 12 h。

3、細(xì)胞破碎：菌液離心 10 min（4000 g，4 ℃），重懸于 30 mL PBS，加入 PMSF 和 tritonX-100 冰浴 1 h 后超聲破碎，破碎菌液在 4 ℃ 轉(zhuǎn)入 50 mL 離心管，12000 rpm 離心10 min，取上清液用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾雜質(zhì)。

4、蛋白純化：采用 Ni-NTA 純化系統(tǒng)進(jìn)行鎳柱親和層析純化目的蛋白，純化后跑電泳，分析蛋白純度。

注意事項(xiàng)

1. PCR 條件與程序需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行梯度摸索。

2. T4 連接酶在高溫不穩(wěn)定，通常 16 ℃ 連接過(guò)夜，在 25 ℃ 左右的室溫能維持七八個(gè)小時(shí)。

常見問題

蛋白誘導(dǎo)表達(dá)效果不好（蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件并不一定適用所有實(shí)驗(yàn)室，需要自己做實(shí)驗(yàn)摸索條件）。

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